干细胞行业“大地震”

干细胞行业“大地震”

一直以来被尊为心脏干细胞“鼻祖”的Piero Anversa，其研究造假会不会影响干细胞治疗心脏病的前景？

仿佛一场学术界的“大地震”即将发生。

观察网站（Retraction Watch）10月14日报道，哈佛大学请求学术期刊撤销心脏干细胞专家Piero Anversa教授所发表的31篇有关心肌干细胞研究的论文。目前很多知名杂志也陆续公布了一些撤稿或警示声明，国内诸多媒体也对此消息纷纷转载和讨论。

“地震”的原因：一方面是因为心肌干细胞不是Piero Anversa一个团队在研究，全世界范围内成千上万的基础和临床科学工作者都在研究，是一个热门领域。另一方面，许多媒体在转载这些消息时并没有准确理解这些消息的内容，甚至错误理解为Piero Anversa团队的工作是所有心脏干细胞研究的基石，由此得出结论认为心脏干细胞的基础理论都将被改写，有关干细胞治疗心脏病的临床研究结果也将被推翻。病人更是担心，翘首以盼的干细胞治疗将是一场“白日梦”。

那么，心肌干细胞的研究是否仍有前景？为此，笔者对Piero Anversa教授团队和其它团队的心肌干细胞研究进行梳理和深入分析。

【为何是“大地震”】

揭密Anversa造假研究的影响力

要理解Anversa造假的影响力，就必须了解心肌干细胞的研究历程。

心脏相关疾病是世界上发病率和死亡率较高的疾病之一。虽然目前的治疗策略在一定程度上改善了疾病的症状并延长病人寿命，但都没有从根本上解决心肌组织损失的问题。因此，干细胞/祖细胞疗法成为心脏修复和再生的重要研究。

Anversa的早期研究为心脏病的治疗点燃新的希望，因为他提出了2个重要理论：1.心肌中存在可以再生心脏的干细胞；2.骨髓干细胞可以横向分化为心肌细胞。

2001年，Anversa发现，在梗死组织的周围，Ki-67阳性的心肌细胞约有4%，而其它部位只有1%。Ki-67是一个核蛋白，与细胞分裂有关，是细胞增殖的经典标志。他们还观察到了典型的细胞分裂现象。这些现象表明在心梗后存在细胞增殖。相关论文发表在2001年6月的《新英格兰医学杂志》上。以往的观点一直认为心脏是终末分化的器官，出生后不再有细胞分裂。这个研究的重要性在于它为心脏病的治疗带来了新的希望。

同年，Anversa在《自然》杂志发表论文，证明来自造血干细胞的c-kit阳性（Lin-c-kit+）细胞注射到心梗后小鼠心脏可以产生心肌细胞。这个研究引起了更大轰动，更在全世界兴起了骨髓干细胞和单核细胞治疗心梗和心功能不全的临床研究热潮。这股热潮至今未减。

2003年，Anversa等在《细胞》杂志发表文章，称他们找到了心脏的干细胞。和骨髓造血干细胞类似，来自心脏的Lin-c-kit+细胞具有干细胞的特征，即克隆性生长、自我更新、多向分化。c-kit基因属于原癌基因，是干细胞因子的受体，可通过一系列信号通路参与造血干细胞增殖分化的调控，是公认的造血干细胞标志。

2011年，Anversa团队发表了代号SCIPIO的临床研究。研究采用自体的Lin-c-kit+心肌干细胞。结果显示干细胞输注可以提高病人的左心室功能和减少疤痕。

2013年伦敦国王学院的Nadal-Ginard团队在《细胞》也发表了一篇文章，进一步指出Lin-c-kit+干细胞是心肌梗死后再生所必须。不过，笔者发现，Nadal-Ginard教授也是2003年Anversa等在《细胞》发表文章的作者之一。两篇文章之间是否有关？我们拭目以待。

至于Piero Anversa的个人介绍，曾经或正在任职的机构官网上都没有找到资料，但在其它网站上可以找到一些。笔者在2013年梵蒂冈举行的第二届国际再生医学会议的官网看到对Piero Anversa的介绍，如“领衔的心血管专家，对再生医学做出杰出贡献”。2014年5月，Anversa访问中国生物技术发展中心，该中心官网介绍其为“美国哈佛大学医学院终身教授，再生医学中心主任，国际心血管领域的顶尖专家，在心脏、肺、胰岛干细胞等方面创造多个世界第一”。

可以这么说，Piero Anversa因“发现”心脏含有c-kit阳性干细胞而出名。

因此，了解Anversa研究的全貌，便可知为什么其学术造假会对心脏干细胞领域造成如此大的影响。

【造假事件始末】

开始与发酵

首先是关于造血干细胞横向分化为心肌细胞的论文。

科学研究的任何突破都会引起同行的极大兴趣并试图进行更加深入的研究。这些c-kit+造血干细胞可用于治疗心脏病，自然引起了很多人的兴趣。然而，国际上很多其他的实验室不能重复Anversa等人在《自然》杂志发表的关于造血干细胞横向分化为心肌细胞的实验结果。包括斯坦福大学医学院的Robert C. Robbins教授团队，他们报道c-kit+骨髓细胞、Lin-c-kit+骨髓细胞和c-kit+ Thy1.1lo Lin- Sca-1+造血干细胞都不能转化为心肌细胞。印第安纳大学的Loren J. Field教授也同样没有重复出Anversa等人的研究结果。

其次是关于心肌干细胞的论文。

美国辛辛那提儿童医院心血管生物学家Jeffery Molkentin于2014年在《自然》杂志发表论文，证明成年小鼠心脏中的c-kit+细胞几乎从未产生新的心肌细胞，但可产生血管内皮细胞。2015年12月4日《Cell Research》杂志在线发表的中国科学院上海生命科学研究院营养科学研究所研究结果显示，不论是在心脏的生理稳态期还是心脏梗死后，c-kit+细胞都极少贡献心肌细胞，大部分c-kit+细胞都是血管内皮细胞。这与Jeffery Molkentin等的研究结果相一致。

2014年3月25日，哈佛医学院的Faculty and Research Integrity学院院长Gretchen Brodnicki致信《柳叶刀》杂志，提出Anversa团队在2011发表的SCIPIO研究论文的辅助图2A和3存在疑问。

同年4月22日，《循环》杂志撤回Anversa团队在2012年发表的一篇论文，因为部分数据确系造假。

2014年年底，接受学术不端行为调查的Anversa和另一名同事Annarosa Leri起诉哈佛大学和布莱根妇女医院，认为由两家机构发起的调查损害了他们的职业生涯。

2017年4月27日，布莱根妇女医院赔偿美国政府1000万美元，以解决一起研究欺诈指控。该研究欺诈指控即指Anversa等人涉嫌学术不端、在项目申请书中通过伪造数据和图片来欺骗性获得和使用美国国立卫生研究院（NIH）项目经费。哈佛医学院和布莱根妇女医院尚未对外公布这31篇论文具体发表在哪些期刊上，但已经通知了所有相关期刊。Anversa的31篇论文一旦被撤回，将使他成为世界上撤回论文最多的前20名科学家之一。

最新进展

2018年10月29日，美国国立心肺血液研究所宣布停止代号“CONCERT-HF”的研究。CONCERT-HF研究对象为慢性心衰的病人，目的是验证c-kit+细胞单用或联合骨髓间充质干细胞使用是否会改善病人的心脏功能。研究使用的细胞是按照新药管理，得到FDA的批准的。研究从2015年开始，目标是募集144名病人。目前已经入组125名病人，其中117名病人完成了心脏组织和骨髓的采集，90名病人已经完成了治疗。

11月8日，《新英格兰医学杂志》表示，Anversa团队在2001年发表的论文可能存在问题，但还没有证据表明有造假，因此还没有到撤稿的程度。笔者观察到，到2018年11月14日，相关论文的引用数量达829次。

【主要争议点】

问题1：心肌干细胞到底能不能再生心肌细胞？

关于c-kit+阳性心肌干细胞的争论可能还要维持一段时间才有结果。

通过检索，笔者发现，路易斯维尔大学的Roberto Bolli教授团队按照Anversa团队2003年《细胞》杂志的方法获得c-kit+阳性细胞，并移植到心梗小鼠，一年后发现治疗组小鼠心脏疤痕较小，具有更多的心肌组织，左心室重构改善，心功能也明显好于对照组。Y染色体检测发现有4%～8%的细胞来自移植的供者细胞，但这些细胞不具备成熟的心脏细胞的特征。不过他们发现，c-kit+细胞移植能够促进心梗小鼠心肌细胞和内皮细胞增殖。因此他们推断，长期存活的c-kit+细胞（包括干细胞）通过旁分泌功能起到了治疗效果。笔者注意到，Bolli教授团队虽然采用了Anversa团队的方法获得c-kit阳性细胞，但并没有证明这些细胞是干细胞。

中国科学院的细胞生物学家周斌今年4月份在《Circulation》上发表的一项研究，也否定了心肌干细胞能生成新心肌细胞的观点。

问题2：CDC的疗效能佐证心肌细胞的再生吗？

此次事件中，心肌球源干细胞(cardiosphere-derived cell，CDC)也成为一个焦点，因为CDC也含有c-kit+细胞。

除了在动物实验中被证实疗效外，多项临床研究也证明了CDC的疗效。

如CADUCEUS试验（美国悉达斯西奈心脏研究院和约翰斯·霍普金斯大学共同完成），发现CDC治疗后1年，心脏组织有生理意义的再生。

DYNAMIC试验（由美国悉达斯西奈心脏研究院、约翰斯·霍普金斯大学、雅典医学院和爱因斯坦医学中心共同完成）观察到，冠状动脉内输注异体CDC到扩张型心肌病（缺血性和非缺血性）患者，1年后的随访显示LVEF明显改善。

该研究用的CDC为Capricor公司产品，其CDC产品（代号CAP-1002）已在今年２月被美国FDA认定为再生医学先进疗法(RMAT)，目前也在进行治疗杜氏肌营养不良（DMD）的Ⅱ期临床研究。CAP-1002为来自供体心脏的异体细胞。

日本冈山大学附属医院的TICAP试验，对患者3个主要冠状动脉输注自体CDC。18个月后心脏MRI显示右心室EF、心脏组织再生和心力衰竭有显著临床意义的改善。

ALLSTAR试验由美国悉达斯西奈心脏研究院、明尼苏达心脏研究院、Scripps医学中心、杜克临床研究院、加州大学圣地亚哥分校和约翰斯·霍普金斯大学共同完成，对冠状动脉内注射同种异体CDC（细胞为Capricor公司的CAP-1002），治疗组1年后心脏MRI显示梗死面积相对减少了15%。

但CDC究竟是如何对心梗起作用呢？

虽然CDC具备干细胞的特征，但研究者认为CDC并不是通过直接分化为心肌细胞起效。CDC通过2个机制诱导心脏组织再生：募集祖细胞与激活原有心肌细胞增殖。争议在于——哪个机制更重要？

虽然CDC移植后观察到祖细胞直接分化为心肌细胞，但新分化的心肌细胞占比很小。新生成的心肌细胞主要位于梗死区周围。除了刺激心肌细胞复制和内源祖细胞分化外，CDC也有保护心脏的作用，包括减少细胞凋亡和抗炎作用。

而CDC的作用不是取决于其分化成新的心肌细胞的能力，而是取决于它们移植后的旁分泌效应。CDC释放的旁分泌因子可促进内源性祖细胞分化以及心肌细胞分裂。CDC分泌的因子包括肝细胞生长因子（HGF）和胰岛素样生长因子-1（IGF-1）。此外，CDC并没有分化为内皮细胞，但通过促进VEGF的生成，可导致血管生成增加，血管密度增加。