CAR-T在实体瘤治疗中的未来与挑战

CAR-T在实体瘤治疗中的未来与挑战

　　嵌合抗原受体(CARs)作为一种人工合成生物受体，主要由两个结构域组成: 胞外域和胞内信号转导区。胞外域位于细胞外部，与环境相互作用。胞内信号转导区，位于细胞内，将细胞外的信号传递到细胞内部。(图1a)。目前，表达肿瘤特异性CAR的T细胞治疗手段在血液瘤的治疗中已经取得了令人振奋的效果。但令人遗憾的是，CAR-T细胞疗法对实体瘤的效果却一直不尽如人意。

　　近日，加州大学洛杉矶分校的Yvonne Y. Chen教授团队在《Nature Reviews Drug Discovery》上发表了题为“Navigating CAR- T cells through the solid-tumour microenvironment”的综述，回顾了在实体瘤中CAR- T细胞治疗受限的内在和外在因素，以及目前克服这些障碍的方法。

　　文章指出，与液体肿瘤相比，CAR- T在实体瘤治疗时面临如下3个关键挑战：(1)由于实体瘤具有高度的异质性，因而很难通过单一抗原的靶向实现所有肿瘤细胞的特异性识别;(2)实体肿瘤通常被物理屏障所包围，限制了T细胞的浸润;(3)浸润到实体瘤中的T细胞面临高度免疫抑制的肿瘤微环境，从而造成其抗肿瘤活性的降低甚至丢失。如何解决上述挑战是实现CAR-T实体瘤治疗的关键。

一．靶标抗原选择

　　靶抗原的选择是CAR- T细胞治疗安全性和有效性的主要决定因素。原则上，理想的靶标应该在肿瘤细胞上高度且均匀表达，而不存在于正常组织细胞上。然而，迄今为止肿瘤的绝大多数抗原同样在健康细胞的亚群中表达。因此，如若仅仅识别肿瘤相关抗原而非肿瘤特异性抗原，则极易带来靶向非肿瘤细胞毒性。

　　为了解决这一问题，过去十年已开发了多种提高CAR- T靶向特异性的策略。其中一种策略是微调CAR靶向抗原的亲和力，这样只有过度表达靶抗原的肿瘤细胞才能被杀伤，而低表达的组织细胞将被分离。然而，这种策略只适用于组织和肿瘤细胞间抗原表达水平差异巨大的情况，并且常常限制CAR-T治疗效果。

　　另一种策略是设计逻辑门CAR-T系统，使得CAR-T细胞在特定抗原组合存在的情况下被激活。例如，CAR具有T细胞激活信号和共刺激信号，而AND逻辑门CAR则将这两个信号分成两个受体，每个受体针对一种抗原，只有这两种抗原都存在时才能彻底激活CAR-T(图1b)。值得注意的是，近年来基于synNotch受体的AND逻辑门CAR-T越来越受到关注。当synNotch受体与靶标结合时，会释放转录因子来诱导CAR的转录，随后CAR与另一靶标结合实现激活(图1b)。尽管这一体系可提升靶向特异性，但当肿瘤抗原在正常细胞上表达时仍会造成细胞毒性。为解决这一问题，AND-NOT逻辑门CAR被开发出来，以识别在肿瘤细胞表达但正常细胞不表达的相关抗原(图1c)。此外，肿瘤异质性是CAR-T只能杀伤部分肿瘤的根本原因。因此，一种可有效靶向异质肿瘤的双特异性CAR-T被提出，其包含两个配体结合域，可识别两种不同的异质肿瘤抗原，其中任一抗原足以触发T细胞活化(图1d)。

　　图1. 人工合成受体CAR-T设计策略

二．实体瘤CAR-T浸润性

　　相较于血液瘤，实体瘤微环境极易招募免疫抑制细胞和基质细胞(例如癌相关成纤维细胞，造成致密纤维化环境)，并造成血管系统失调(降低T细胞浸润所需黏附因子的表达)，从而形成排斥T细胞浸润的物理屏障(图2)。

　　图2. 实体瘤中CAR-T的浸润障碍

　　其中，趋化因子直接影响实体肿瘤中细胞毒性T细胞的浸润程度。目前，多项研究已通过工程化CAR-T细胞，使其表达识别相关趋化因子受体，从而提升CAR-T浸润性。例如，共表达C-C趋化因子受体CCR2、IL-7或CCL19的CAR-T细胞表现出更强的浸润和抗肿瘤功效。此外，细胞外基质蛋白同样是构成实体瘤物理屏障的一大因素，因此一种新的CAR-T工程化策略可通过降解细胞外基质蛋白质以提升CAR-T浸润，例如可分泌乙酰肝素酶的GD2 CAR-T。

　　值得注意的是，肿瘤血管系统具有高度弯曲及血流异常等特征，这有助于肿瘤缺氧，并可通过下调粘附分子(如VCAM1和细胞间粘附分子1)来限制T细胞向肿瘤组织的浸润。因此，使肿瘤血管系统正常化可有效促进免疫浸润，例如靶向血管内皮生长因子(VEGF)和血管生成素信号的CAR-T。而进一步研究表明，与静脉内和肿瘤内给药相比，CAR-T的局部区域给药更有利于改善治疗效果，这为CAR-T应用提供了一种新的思路。基于此，近年来CAR-T细胞递送体系的构建也越来越受到重视。

三．实体瘤免疫抑制微环境

　　在实体瘤中，CAR-T治疗还面临着肿瘤代谢造成的免疫抑制微环境。研究显示，实体瘤中耗竭的CAR-T细胞普遍存在糖酵解、线粒体代谢以及线粒体功能受损等问题，并且肿瘤细胞还会与CAR-T竞争必需的营养素，如葡萄糖和色氨酸等，从而致使CAR-T衰竭;而肿瘤细胞分泌的代谢产物，如乳酸和犬尿氨酸，则会影响效应T细胞增殖和活性，从而影响CAR-T治疗效果(图3)。

　　图3. CAR-T在免疫抑制肿瘤微环境中面临的挑战

　　随着人们对T细胞衰竭生物学的理解不断加深，基因工程策略已被应用于重新激活并增强CAR-T。最近的研究报道Nr4a1、Nr4a2和Nr4a3三重敲除的CAR-T细胞在黑色素瘤中显示出更少的CAR-T衰竭;此外，过表达转录因子AP-1也可增强CAR-T细胞对衰竭的抵抗力;而CAR-T细胞和免疫检查点抑制剂的联合疗法也已被证明可成功抑制T细胞衰竭。

四．CAR-T毒性与安全性

　　尽管CAR-T在实体瘤中疗效有待进一步验证，但其治疗安全性仍需得到充分考虑。除了前面讨论过的靶向非肿瘤细胞毒性外，接受CAR-T细胞治疗的患者还可能出现其它致命的副作用，如细胞因子综合征(CRS)和神经毒性。

　　目前已有多种提升CAR-T安全性和可控性的方案被应用于血液瘤治疗中。例如，生物惰性小分子AP1903可诱导iCasp9二聚化，从而在CRS发作时激活Caspase 9介导的细胞凋亡以关闭CAR-T(图4a)。然而，这些CAR-T自杀开关通常会导致CAR-T细胞的永久性耗竭，从而迫使治疗终止。

　　近年来，一种新策略通过暂时性地调节CAR-T细胞活动，以防止疲劳或严重不良事件的发生。例如，使用酪氨酸激酶抑制剂(达沙替尼)可暂时干扰CAR-T细胞信号级联，实现短暂的CAR-T细胞关闭(图4b)。除达沙替尼外，蛋白质降解标签也已被用于调节CAR蛋白表达，从而使CAR-T细胞信号暂时失效。例如，switch-off CAR(蛋白酶靶点、蛋白酶和脱铁蛋白融合到CAR的C-末端的CAR-T)便可在没有小分子蛋白酶抑制剂的情况下切割蛋白酶靶点，保护CAR免受脱铁素介导的降解(图4c)。

　　图4.提升CAR-T安全性及可控性方案

五．总结

　　目前CAR-T在实体瘤中的治疗仍存在很多阻碍，包括靶标选择困难、T细胞浸润性差、免疫抑制的微环境以及CAR-T治疗毒性等。为了取得这一领域的进展，CAR-T治疗需要更科学地明确治疗目标，制定战胜肿瘤微环境的策略，寻找到在实体瘤中具有特异性的靶点。相信在不久的将来，随着对肿瘤靶点、微环境及相关信号通路理解的逐渐深入，CAR-T在实体瘤中的治疗效果也将迎来跨越式发展。

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